Minggu, 29 April 2012

Cara Uji Kualitas Reagen


Uji kualitas media merupakan satu-satunya upaya dalam penjaminan mutu media atau hasil (output). Jaminan mutu atau kualitas adalah seluruh rangkaian kegiatan laboratorium untuk meyakinkan hasil-hasil yang dikeluarkan dengan mempertimbangkan segi-segi reabilitas, kecepatan, biaya dan relevansinya terhadap klinis serta lingkungan. Sebagai komponen penting dalam pelayanan kesehatan, hasil laboratorium digunakan untuk penetapan diagnosis, pemberian pengobatan, serta penentuan prognosis. Oleh karena itu hasil pemeriksaan laboratorium harus selalu terjamin mutunya.
Masalah kualitas pada bidang kimia klinik agak lebih sederhana dibanding bidang mikrobiologi. Karena kualitas hasil akhir dapat diukur dengan parameter secara obyektif terutama akurasi dan presisi, dimana kedua-duanya dapat dipertanggung jawabkan, serta penilaian berupa angka atau statistik.
Mikrobiologi merupakan suatu cabang ilmu yang kurang kuantitatif sehingga pengertian kualitas hasil akhir lebih ditekankan kepada kesempurnaan teknis. Untuk mencapai, menjaga, melakukan perbaikan berkesinambungan dan meningkatkan kualitas hasil akhir, mutlak perlu dilaksanakan pemantapan mutu (Quality Assurance) yang mencakup komponen: Pemantapan Mutu Internal, Pemantapan Mutu Eksternal, Akreditasi, Audit, Validasi Hasil, Diklat Berkelanjutan.
Pelaksanaan pemantapan mutu bidang mikrobiologi merupakan manajemen pengendalian mutu laboratorium mikrobiologi mencakup: Pengendalian mutu tahap pra analitik, Pengendalian mutu tahap analitik dan Pengendalian mutu tahap pasca analitik. Kualitas pemeriksaan bidang mikrobiologi sangat bergantung kepada kualitas media yang dipakai.
Media kultur dapat disediakan baik dalam bentuk base (dasar) kering secara komersial, dari racikan bahan-bahan baku yang berbeda atau dari media yang siap pakai yang dikemas dalam tabung dan cawan plastik. Walaupun media siap pakai ini masih diperdebatkan penggunaannya, kebanyakan ahli sangat setuju terutama dalam bentuk cairan karena lebih efisien dan ekonomis.
Perusahaan-perusahaan komersial yang ternama itu juga mempunyai program quality control sendiri dan dapat membuat media dengan hasil jauh lebih baik, serta kepekaan yang lebih tinggi dibanding yang dibuat sendiri oleh laboratorium pemakai. Jika biaya tenaga kerja meningkat dan waktu yang dibutuhkan untuk quality control bertambah maka penyediaan media dari ramuan bahan-bahan mentah tidak dianjurkan. Bakteri seperti mahluk hidup lainnya memerlukan nutrisi untuk pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam mengkultivasi (penanaman), mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme.
Mikroorganisme memiliki karakteristik dan ciri-ciri yang berbeda di dalam persyaratan pertumbuhannnya. Ada mikroorganisme yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung sulfur dan ada pula yang tidak mampu, dan hal lain seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroorganisme. Bakteri atau mikroorganisme lainnya agar dapat dibiakkan didalam laboratorium memerlukan media yang memungkinkan tumbuh dan berkembang secara optimal. Oleh karena itu media pembiakan harus mengandung cukup nutrien untuk pertumbuhan mikroorganisme, selain suhu dan pH. Meskipun persyaratan nutrien bakteri amat beragam, namun sebagai mahluk hidup, mereka mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air, karbon, energi, mineral. Untuk itu hasil laboratorium mikrobiologi yang berkualitas tinggi dapat diartikan sebagai suatu laporan yang sangat membantu dalam pencegahan atau penanggulangan penyakit. Tes laboratorium yang dikerjakan dengan sempurna diharapkan akan berkualitas tinggi, jika didukung media dan bahan dasar yang baik pula. Oleh karenanya penulisan panduan ini memiliki sasaran yaitu standar yang baik pada media.

Sabtu, 21 April 2012

Uji Motilitas Bakteri

Dasar Teori
 Diantara ciri-ciri utama sel bakteri yang dipelajari adalah ukuran, bentuk, susunan dalam kelompok, struktur sel, dan bagian-bagian lain yang memberi ciri khas bagi pengenalan bakteri tersebut seperti flagel, kapsul, spora dan sebagainya. Motilitas suatu bakteri juga merupakan ciri khas bagi pengenalan bakteri. Yang dimaksud dengan gerak ini adalah sifat atau kemampuan bakteri untuk dapat berpindah tempat dengan menggunakan salah satu bagian tubuhnya. Jadi bukan gerak yang disebabkan oleh pengaruh luar, seperti bergetar atau gerak maju mundur yang disebabkan oleh benda-benda halus yang berada dalam cairan suspensi, sebagai akibat pertumbukan molekul-molekul cairan dengan bakteri tersebut (gerak semacam ini disebut gerak Brown). Salah satu bagian tubuh atau organ yang dimaksud adalah flagel. Bakteri dapat bergerak dengan menggunakan flagel, akan tetapi flagel tidak ditemukan pada semua jenis bakteri. Oleh karena itu dapat atau tidaknya bakteri bergerak merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan  dalam identifikasi bakteri.
Diantara banyak anggota Protista sekurang-kurangnya ada empat gerakan berpindah yang dapat dibedakan, yaitu gerak amoeboid, gerak meluncur, gerak yang disebabkan oleh berputarnya sel berbentuk sawa (Spirochaetales), dan gerak yang disebabkan adanya gerak seperti mendayung oleh flagel atau bulu cambuk. 
Flagel sebagai alat gerak bakteri adalah suatu organ berupa benang yang berpangkal dalam sitoplasma (Indrawati, dkk., 2002) atau flagel adalah semacam untai rambut yang menembus keluar dinding sel dan menimbulkan gerak berenang (Usman, 1987). Sedangkan menurut Pelczar (1986) flagelum adalah embel-embel seperti rambut yang teramat tipis mencuat menembus dinding sel dan bermula dari tubuh dasar, suatu struktur granular tepat di bawah membran sel di dalam sitoplasma (jamak, flagela). Flagelum inilah yang menyebabkan motilitas pada sel bakteri.      


Flagel tersusun dari tiga atau lebih serat paralel atau melilit memanjang, terbuat dari protein tipe flagelin yaitu semacam miosin, lebih halus dari flagel ialah bulu getar (silia) eukarion. Tiap serta adalah rantai polipeptida berbentuk sawa. Flagel terdiri dari tiga bagian :
1.      Tubuh dasar
            Bagian dasar flagel berhubungan dengan membran sitoplasma dan dinding sel.
2.      Struktur seperti kait
Struktur ini terdiri dari dua (pada bakteri Gram positif) atai empat (pada bakteri Gram negatif) bagian berupa cincin yang melekatkan flagel itu pada membra sitoplasma dan dinding sel. Tersusun dari subunit protein (monomer) yang diatur dalam pola sawa. Hilangnya dinding sel tidak mengganggu flagel, hanya bila dinding sel tidak ada, gerak bakteri itu berkurang.
3.      Sehelai filamen panjang di luar dinding sel
Bahan filamen berbentuk sawa, biasanya beberapa kali lebih panjang dari selnya sendiri.
Lama benar orang tidak tahu dengan pasti, apakah flagel itu tumbuh pada dinding sel ataukah mempunyai akar di dalam sitoplasma, atau mungkinkah flagel itu hanya merupakan kepanjangan protoplasma melalui celah-celah di dalam dinding sel. Elektron mikroskop menunjukan bahwa flagel itu benang-benang protoplasma yang berpangkal pada titik-titik tepat di bawah membran sel; pangkal itu disebut rizoblast (Dwidjeseputro, 1980). Tetapi menurut  Usman (1987), terdapat flagel yang memiliki flagel ekstern. Tetapi didalam selnya terdapat strukur yang mirip flagel tepat di bawah pembungkus luar sel, dan dinamakan flagel periplasma, pernah disebut fibril taksis atau endoflagel. Inilah yang menyebabkan gerak spirokheta, tetapi bagaimana terlaksananya masih belum jelas diketahui.
Flagel menurut letak dan jumlahnya merupakan salah satu ciri yang dapat digunakan dalam identifikasi bakteri. Macam-macam letak flagel:
-          monotrik; (monotrich; monos, tunggal; thrix, rambut) satu flagel pada salah satu ujung sel bakteri. Contoh bakteri Pseudomonas aeruginosa
-          amphitrik; (amphitrich; amphi, dua-dua) satu flagel pada kedua ujung sel bakteri. Contoh bakteri
Spirillum serpens
-          lofotrik; (lophotrich; lophos, tumbuh berupa segumpal rambut) lebih dari satu flagel pada salah
satu atau kedua ujung sel bakteri. Contoh Pseudomonas flourescens
-          peritrik; (peritrich; peri, sekitar) flagel keluar dari tiap bagian permukaan sel bakteri. Contoh
bakteri Salmonella typhii
-     atrik; tidak ada flagel, umumnya bakteri berbentuk kokus.
Karena ada bukti-bukti bahwa bakteri yang amfitrik itu sebenarnya bakteri yang sedang atau akan membelah diri, maka timbullah pendapat baru untuk mengadakan dua klasifikasi saja mengenai kedudukan flagel, yaitu flagel terminal yang terdapat pada ujung saja seperti Vibrio, Spirillum, dan Pseudomonas, dan flagel lateral seperti halnya Escherichia coli, Proteus vulgaris serta pada beberapa Bacillus dan Clostridium yang dapat bergerak. 

Pengecatan Flagel Metode Gray
Flagel adalah alat gerak berbentuk cambuk pada sejumlah organisme bersel satu.
Flagel tersusun atas 3 bagian,yaitu :


    Pangkal (basal) merupakan bagian yang berhubungan dengan membrane plasma
-        Hook yang pendek
-        Filamen yang menyerupai benang yang panjangnya sampai beberapa kali melebihi panjang tubuhnya.
Lalu bagaimana cara mengetahui adanya flagel pada bakteri?
Yaitu dengan melakukan pengecatan flagel, metode yang digunakan adalah metode gray
1.       Tujuan Pengecatan              : untuk mengetahui adanya flagel pada bakteri
2.      Prinsip                       : flagel mampu mengikat zat warna karena penggunaan mordant dan berwarna merah ungu apabila dilakukan pengecatan metode Gray
3.      Alat dan bahan       :
·       Objek glass
·       Pipet tetes steril
·       Pembakar spirtus
·       Sampel bakteri
·       Incubator
·       Cat mordant dan carbol fuchsin
·       Mikroskop
·       Emersi oil
4.     Cara kerja                 :
A.     Lakukan uji motil lebih dahulu
B.     Pembuatan preparat
·       Siapkan objek glass yang bersih,kering,bebas lemak
·       Teteskan 1 tetes sampel bakteri di tepi objek glass menggunakan pipet tetes steril secara aseptis
·       Objek glass dimiringkan sehingga tetesan mengalir keujung yang lain
·       Keringkan objek glass dalam incubator suhu 56oC selama 10 menit
C.    Pengecatan
·       Genangi preparat dengan larutan mordant selama 10 menit, buang sisa cat cuci dengan air mengalir
·       Genangi dengan carbol fuchsin 5 menit, buang sisa cat cuci dengan air mengalir
·       Kering anginkan
·       Amati di bawah mikroskop dengan lensa objektif 100x + emersi oil (perbesaran 1000x)
5.      Hasil                           :

6.      Kesimpulan                            : dalam sampel ditemukan bakteri batang memiliki organelle flagel                                                       peritrik


7.      Pembahasan            :
Flagel memungkinkan bakteri bergerak menuju kondisi lingkungan yang menguntungkan dan menghindar dari lingkungan yang merugikan bagi kehidupannya.
Pada pengecatan flagel, sebelum ditetesi carbol fuchsin terlebih dahulu ditetesi/digenangi mordant.
Fungsi mordant :
-      Untuk mengintensifkan pengikatan cat
-      Untuk memperjelas diameter flagel
-      Memberi warna yang kontras
Terdiri dari campuran :
5 cc larutan jenuh kalium aluin dalam aquades
2 cc larutan asam tanin 20% dalam aquades
2 cc HgCl 2 jenuh dalam aquades
0,4 cc larutan basic fuchsin jenuh dalam alcohol 96%
Berdasarkan letak dan jumlah flagel bakteri dibedakan :
-      Artik (tidak berflagel)        : bakteri coccus
-      Monotrik (flagel tunggal di ujung ) : Vibrio cholera, E.coli
-      Lofotrik (satu/seberkas flagel di salah 1 ujung) : Pseudomonas aeroginusa , Spirilum volutant
-      Amfitrik (satu/seberkas flagel di ke2 ujung ) : Spirillum seifem
-      Peritrik (flagel di seluruh permukaan tubuh ) : Proteus vulgaris


-   

Jumat, 20 April 2012

menghitung jumlah leukosit metode pipet

Jumlah Leukosit (Sel Darah Putih)

Jumlah leukosit lebih sedikit dibandingkan dengan eritrosit. Pada laki-laki dan perempuan dewasa setiap mm kubiknya darah hanya terdapat kira-kira 4.500 sampai 10.000 jumlah butir. Leukosit mempunyai bentuk bervariasi dan mempunyai ukuran lebih besar dari eritrosit. Leukosit mempunyai inti bulat dan cekung. Sel-sel ini dapat bergerak bebas secara amuboid serta dapat menembus dinding kapiler (diapedesis).
Jenis Leukosit 

Leukosit dapat dibedakan menjadi dua, yaitu leukosit granulosit ( plasmanya bergranula = basofil , eosinofil, neutrofil ) dan leukosit agranulosit ( plasmanya tidak bergranula = limfosit, monosit ). Apa perbedaan kedua jenis leukosit tersebut? Pelajarilah dalam Tabel 5.3 berikut.
Pembentukan & Fungsi Leukosit

Leukosit dibentuk dalam sumsum tulang merah, limpa, kelenjar limpa, dan jaringan retikuloendotelium. Tugas utama leukosit adalah ”memakan” kuman penyakit dan benda-benda asing lain, seperti bakteri yang ada di dalam tubuh. Oleh sebab itu, leukosit dikenal sebagai fagosit.
Hitung Leukosit
Hitung leukosit adalah menghitung jumlah leukosit per milimeterkubik atau mikroliter darah. Leukosit merupakan bagian penting dari sistem pertahanan tubuh, terhadap benda asing, mikroorganisme atau jaringan asing, sehingga hitung julah leukosit merupakan indikator yang baik untuk mengetahui respon tubuh terhadap infeksi.
Jumlah leukosit dipengaruhi oleh umur, penyimpangan dari keadaan basal dan lain-lain. Pada bayi baru lahir jumlah leukosit tinggi, sekitar 10.000-30.000/μl. Jumlah leukosit tertinggi pada bayi umur 12 jam yaitu antara 13.000-38.000 /μl. Setelah itu jumlah leukosit turun secara bertahap dan pada umur 21 tahun jumlah leukosit berkisar antara 4500- 11.000/μl. Pada keadaan basal jumlah leukosit pada orang dewasa berkisar antara 5000 — 10.000/μl. Jumlah leukosit meningkat setelah melakukan aktifitas fisik yang sedang, tetapi jarang lebih dari 11.000/μl. Peningkatan jumlah leukosit di atas normal disebut leukositosis, sedangkan penurunan jumlah leukosit di bawah normal disebut lekopenia.
Terdapat dua metode yang digunakan dalam pemeriksaan hitung leukosit, yaitu cara automatik menggunakan mesin penghitung sel darah (hematology analyzer) dan cara manual dengan menggunakan pipet leukosit, kamar hitung dan mikroskop.
Cara automatik lebih unggul dari cara pertama karena tekniknya lebih mudah, waktu yang diperlukan lebih singkat dan kesalahannya lebih kecil yaitu ± 2%, sedang pada cara manual kesalahannya sampai ± 10%. Keburukan cara automatik adalah harga alat mahal dan sulit untuk memperoleh reagen karena belum banyak laboratorium di Indonesia yang memakai alat ini.
Nilai normal leukosit:
Dewasa                : 4000-10.000/ µL
Bayi / anak          : 9000-12.000/ µL
Bayi baru lahir    : 9000-30.000/ µL
Bila jumlah leukosit lebih dari nilai rujukan, maka keadaan tersebut disebut leukositosis. Leukositosis dapat terjadi secara fisiologik maupun patologik. Leukositosis yang fisiologik dijumpai pada kerja fisik yang berat, gangguan emosi, kejang, takhikardi paroksismal, partus dan haid.
Peningkatan leukosit juga dapat menunjukan adanya proses infeksi atau radang akut, misalnya pneumonia, meningitis, apendisitis, tuberkolosis, tonsilitis, dll. Dapat juga terjadi miokard infark, sirosis hepatis, luka bakar, kanker, leukemia, penyakit kolagen, anemia hemolitik, anemia sel sabit , penyakit parasit, dan stress karena pembedahan ataupun gangguan emosi. Peningkatan leukosit juga bisa disebabkan oleh obat-obatan, misalnya: aspirin, prokainmid, alopurinol, kalium yodida, sulfonamide, haparin, digitalis, epinefrin, litium, dan antibiotika terutama ampicillin, eritromisin, kanamisin, metisilin, tetracycline, vankomisin, dan streptomycin.
Leukopenia adalah keadaan dimana jumlah leukosit kurang dari 5000/µL darah. Karena pada hitung jenis leukosit, netrofil adalah sel yang paling tinggi persentasinya hampir selalu leukopenia disebabkan netropenia.
Penurunan jumlah leukosit dapat terjadi pada penderita infeksi tertentu, terutama virus, malaria, alkoholik, SLE, reumaotid artritis, dan penyakit hemopoetik(anemia aplastik, anemia perisiosa). Leokopenia dapat juga disebabkan penggunaan obat terutama saetaminofen, sulfonamide, PTU, barbiturate, kemoterapi kanker, diazepam, diuretika, antidiabetika oral, indometasin, metildopa, rimpamfin, fenotiazin, dan antibiotika.(penicilin, cefalosporin, dan kloramfenikol)
Hitung Jenis Leukosit
Hitung jenis leukosit digunakan untuk mengetahui jumlah berbagai jenis leukosit. Terdapat lima jenis leukosit, yang masing-masingnya memiliki fungsi yang khusus dalam melawan patogen. Sel-sel itu adalah neutrofil, limfosit, monosit, eosinofil, dan basofil. Hasil hitung jenis leukosit memberikan informasi yang lebih spesifik mengenai infeksi dan proses penyakit.  Hitung jenis leukosit hanya menunjukkan jumlah relatif dari masing-masing jenis sel. Untuk mendapatkan jumlah absolut dari masing-masing jenis sel maka nilai relatif (%) dikalikan jumlah leukosit total (sel/μl).
Untuk melakukan hitung jenis leukosit, pertama membuat sediaan apus darah yang diwarnai dengan pewarna Giemsa, Wright atau May Grunwald. Amati di bawah mikroskop dan hitung jenis-jenis leukosit hingga didapatkan 100 sel. Tiap jenis sel darah putih dinyatakan dalam persen (%). Jumlah absolut dihitung dengan mengalikan persentase jumlah dengan hitung leukosit, hasilnya dinyatakan dalam sel/μL.
tabel:
Jenis
Nilai normal
Melebihi nilai normal
Kurang dari nilai normal
Basofil
0,4-1%
40-100/µL
inflamasi, leukemia, tahap penyembuhan infeksi atau inflamasi
stress, reaksi hipersensitivitas, kehamilan, hipertiroidisme
Eosinofil
1-3%
100-300/µL
Umumnya pada keadaan atopi/ alergi dan infeksi parasit
stress, luka bakar, syok, hiperfungsi adrenokortikal.
Neutrofil
55-70%
(2500-7000/µL)
Bayi Baru Lahir 61%
Umur 1 tahun 2%
Segmen 50-65% (2500-6500/µL)
Batang 0-5% (0-500/µL)
Inflamasi, kerusakan jaringan, peyakit Hodgkin, leukemia mielositik, hemolytic disease of newborn, kolesistitis akut, apendisitis, pancreatitis akut, pengaruh obat
Infeksi virus, autoimun/idiopatik, pengaruh obat-obatan
Limfosit
20-40%
1700-3500/µL
BBL 34%
1 th 60%
6 th 42%
12 th 38%
infeksi kronis dan virus
kanker, leukemia, gagal ginjal, SLE, pemberian steroid yang berlebihan
Monosit
2-8%
200-600/µL
Anak 4-9%
Infeksi virus, parasit, anemia hemolitik, SLE< RA
Leukemia limfositik, anemia aplastik
Laju Endap Darah
Laju endap darah (erithrocyte sedimentation rate, ESR) adalah kecepatan sedimentasi eritrosit dalam darah yang belum membeku, dengan satuan mm/jam. LED merupakan uji yang tidak spesifik. LED dijumpai meningkat selama proses inflamasi akut, infeksi akut dan kronis, kerusakan jaringan (nekrosis), penyakit kolagen, rheumatoid, malignansi, dan kondisi stress fisiologis (misalnya kehamilan).
Metode yang digunakan untuk pemeriksaan LED ada dua, yaitu metode Wintrobe dan Westergreen. Hasil pemeriksaan LED dengan menggunakan kedua metode tersebut sebenarnya tidak seberapa selisihnya jika nilai LED masih dalam batas normal. Tetapi jika nilai LED meningkat, maka hasil pemeriksaan dengan metode Wintrobe kurang menyakinkan. Dengan metode Westergreen bisa didapat nilai yang lebih tinggi, hal itu disebabkan panjang pipet Westergreen yang dua kali panjang pipet Wintrobe. International Commitee for Standardization in Hematology (ICSH) merekomendasikan untuk menggunakan metode Westergreen.
Prosedur pemeriksaan LED yaitu:
  1. Metode Westergreen
  • o Untuk melakukan pemeriksaan LED cara Westergreen diperlukan sampel darah citrat 4 : 1 (4 bagian darah vena + 1 bagian natrium sitrat 3,2 % ) atau darah EDTA yang diencerkan dengan NaCl 0.85 % 4 : 1 (4 bagian darah EDTA + 1 bagian NaCl 0.85%). Homogenisasi sampel sebelum diperiksa.
  • o Sampel darah yang telah diencerkan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung Westergreen sampai tanda/skala 0.
  • o Tabung diletakkan pada rak dengan posisi tegak lurus, jauhkan dari getaran maupun sinar matahari langsung.
  • o Biarkan tepat 1 jam dan catatlah berapa mm penurunan eritrosit.
  1. Metode Wintrobe
  • o Sampel yang digunakan berupa darah EDTA atau darah Amonium-kalium oksalat. Homogenisasi sampel sebelum diperiksa.
  • o Sampel dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe menggunakan pipet Pasteur sampai tanda 0.
  • o Letakkan tabung dengan posisi tegak lurus.
  • o Biarkan tepat 1 jam dan catatlah berapa mm menurunnya eritrosit.
    Nilai Rujukan
  1. Metode Westergreen:
  • Laki-laki : 0 – 15 mm/jam
  • Perempuan : 0 – 20 mm/jam
  1. Metode Wintrobe :
  • Laki-laki : 0 – 9 mm/jam
  • Perempuan 0 – 15 mm/jam
 
 

Kamis, 12 April 2012

macam-macam pengecatan bakteri


Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri merupakan organisme mikroskopis yang mempunyai ciri-ciri : tubuh uniseluler, tidak berklorofil, bereproduksi dengan membelah diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara, dan makhluk hidup), dan aktif bergerak pada kondisi lembab. Beberapa bentuk bakteri yaitu basil, kokus, dan spirilum. Bentuk-bentuk tersebut dapat menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi bergantung pada kondisi pertumbuhannya. Hal ini dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan bakteri (Edukasi, 2008).
Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Salah satu cara untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan in warna (chromophore) yang bermuatan positif sehingga bakteri yang bermuatan negatif menarik chromophore kationik.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi pada 


1.1.Pengecatan Tunggal

Tujuan :
Melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna
Teori Dasar
Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telajang. Untuk mengetahui  struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri, kita perlu melakukan pengecatan terhadap bakteri tersebut.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna yang biasa dijadikan utnuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuschin, dan crystal violet. Semua zat warna ini bekerja baik terhadap bakteri karena mengahsilkan ion warna (chromophore) yang mempunyai muatan positif. Bakteri mempunyai muatan negatif sehingga menarik hromophore kationik
Zat warna digolongkan ke dalam zat warna basa contohnya methylene-blue (methylene+ chloride-) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionik cotohnya eosin (sodium+ eosinate-). Chromophore anionik, eosinate- tidak dapat dipakai mengecat bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik - 2 menit tergantung pada afinitas zat warna. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah 





1.1.Pengecatan Spora Bakteri (Metode Klein dan Wirtz)
Tujuan :
Melihat bentuk spora di dalam sel bakteri.
Teori :
Bakteri dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetative menjadi spora bila keadaan memburuk. Pada bentuk spora kegiatan bakteri akan berhenti ( dorman atau tidak melakukan metabolisme dan tidak bereproduksi). Dalam bentuk ini bakteri sangat resisten dan dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama meskipun lingkungan dalam keadaan yang kurang baik.
Sifat spora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Berdasarkan letak sporanya dikenal tiga macam letak, yaitu: sentral, subterminal dan terminal.
Berdasarkan posisinya bakteri dibedakan atas:
1.  Endospora, dibentuk didalam sel itu sendiri.
  1. Ditengah sel (sentral). Contoh Bacillus Cereus.
  2. Di ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium thuringensis.
  3. Didekat ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium subterminale.
Endospora adalah tubuh kecil yang tahan lama terbentuk didalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru.
1.      Eksospora, dibentuk diluar sel. Contoh Streptomyces. Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal, seperti konidia, yang disangga diujung hifa, suatu filamen vegetatif, pada streptomyces. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora pada cendawan.
Prosedur Kerja
Bahan dan Alat :
1.      Biakan murni Bacillus subtilis
2.      Zat kimia / warna carbol fuchsin, methylene blue, malachite green, safranin.
3.      Asam sulfat dan alkohol.
4.      Gelas objek, Ose, dan Tabung reaksi
5.      Penangas air, Termometer
6.      Mikroskop

Cara Kerja :
A.    Metode Klein I
1.      Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuschin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1.
2.      Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada temperatur  80 0 C .
3.      Buat film dari campuran suspensi diatas.
4.      Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik.
5.      Cuci dengan air, lalu tambahkan methylene blue selama 3 menit.
6.      Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
7.      Amati dengan perbesaran kuat.
8.      Catat dan gambar apa yang terlihat. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.
B.     Metode Klein II
1.      Buat film dari suspensi bakteri
2.      Tambahkan carbol fuschin, panaskan sampai keluar uap . (80 0 C selam 10 menit )..
3.      Langkah-langkah selanjutnya sama dengan metode klein I.
C.     Metode Wirtz
1.      Buat film dari suspensi bakteri.
2.      Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap kurang lebih selama 2 menit.
3.      Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 30 detik.
4.      Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
5.      Amati dengan perbesaran kuat.
6.      Catat dan amati apa yang terlihat. Spora berwarna hijau dan badan bakteri berwarna merah muda.


Hasil dan Pembahasan
Metode Klein II  
Bacillus subtilis 
Badan vegetative: warna biru
Spora : warna merah muda
sel vegetatif: bentuk batang







Metode Wirtz
Bacillus subtilis 
Badan vegetative: merah muda
Spora : warna hijau
sel vegetatif: bentuk batang







Pembahasan
Pada percobaan metode klein II ini, dapat dilihat bahwa setelah pemberian asam sulfat dan methylene blue di atas, dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, bakteri Bacillus subtilus memiliki sel vegetatifnya berbentuk batang dan berwarna biru. Dengan latar sporanya di luar sel vegetatif, dan warna sporanya itu sendiri adalah merah.
Sel spora bakteri memiliki RNA yang mampu mengikat warna sehingga tetap mempertahankan warna merah yang diberikan carbol fuchsin. Sedangkan sel vegetatif tidak mampu mengikat warna merah sehingga sel vegetatif tidak berwarna.  Sel-sel vegetatif baru berwarna biru setelah di beri zat warna methylene blue.
Sedangkan pada percobaan yang kedua yaitu menggunakan metode Wirtz juga sama, pada perobaan bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis tetapi zat warna yang digunakan adalah malachite green, dan pada percobaan ini menggunakan zat warna tandingan yaitu safranin. Sehingga setelah diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, menghasilkan sel vegetatifnya berbentuk seperti batang, dan berwarna merah muda. Latar sporanya berada di luar sel vegetatif, dengan warna sporanya itu sendiri adalah hijau.
Malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Ncbi, 2008).

Kesimpulan
·         Pada bakteri Bacillus subtilis dengan menggunakan metode klein II spora berwarna merah karena diberikan fuchsin, sedangkan sel vegatatif berwarna biru karena diberikan methylene blue.
·         Pada percobaan yang menggunakan metode Wirtz sel spora berwarna hijau karena terwarnai oleh malachite green, sedangkan sel vegetatif berwarna merah muda karena terwarnai oleh safranin.

1.2.Pengecatan Kapsul Bakteri (Metode Buri-Gins dan Maneval)
Tujuan :
Melihat keberadaan kapsul bakteri.
Teori :
Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri terdapat suatu zat semacam lendir atau gum. Karena zat tersebut mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka struktur demikian disebut dengan kapsul bakteri.
Struktur kapsul dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri itu sendiri dan jenis bahan makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan ekskresi dari dinding sel bakteri itu sendiri dan berfungsi untuk melindungi dirinya..
Adanya kapsul pada bakteri pathogen mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang tebal mempunyai virulensi yang lebih tinggi dari pada bakteri dengan kapsul yang tipis atau dengan bakteri yang tidak berkapsul sama sekali.
Pengecatan kapsul disebut juga pengecatan negatif, karena disini yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan objeknya sendiri (kapsul) tidak diwarnai.
Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan sel bakteri digunakan Fuchsin, sehingga badan bakteri menjadi berwarna merah dan kapsulnya didak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval bakteri diwarnai dengan menggunakan Congo red, sedangkan untuk mewarnai latar belakangnya diberi cat Maneval. Badan bakteri akan berwarna merah sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang berwarna hijau.
Bahan dan Alat :
1.      Biakan murni Azotobacter chroococum atau Bacillus subtilis
2.      Zat kimia/warna larutan fuchsin, Congo red, tinta cina, cat maneval, dan media cair.
3.      Gelas objek, Ose, Lampu spirtus, dan Mikroskop
Cara Kerja :
A.    Metode Buri-Gins
  1. Bersihkan gelas objek.
  2. Teteskan satu ose suspensi bakteri di atas gelas objek pada bagian ujungnya.
  3. Teteskan 1-2 ose tinta cina di dekatnya, lalu campurkan.
  4. Buat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan dengan menggunakan gelas objek lain.
  5. Keringkan di udara.
  6. Tambahkan carbol fuchsin selama 1-2 menit.
  7. Keringkan dengan kertas saring.
  8. Amati dengan perbesaran kuat.
  9. Catat dan amati apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam.
B.     Metode Maneval
  1. Teteskan 2 ose Congo red pada gelas objek.
  2. Ambil 2 ose suspensi bakteri, lalu mencampurkan dengan congo red tadi. Membuat film setipis mungkin.
  3. Keringkan di udara.
  4. Tambahkan cat Maneval , diamkan selama 1 menit.
  5. Keringkan dengan kertas saring.
  6. Amati preparat dengan perbesaran kuat.
  7. Catat dan gambar apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang biru.

Hasil Pengamatan
Metode Maneval
                Bacillus subtilis

Badan bakteri: warna merah
Kapsul: tidak berwarna
Latar belakang: hijau.





Pembahasan
Umumnya tidak semua bakteri itu memiliki kapsul, sedangkan fungsi kapsul itu sendiri adalah untuk mendekatkan pada media. Pada percobaan ini, bakteri diberikan setetes sampai 2 tetes tinta cina, setelah itu diberikan karbol fuchsin, dan diamati, sehingga dihasilkan warna kapsul transparan, sedangkan warna pada badan bakteri tersebut merah, dengan warna latarnya adalah hitam.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo, 1990).
            Sedangkan pada percobaan dengan meggunakan metode maneval didapat bahwa bakteri setelah dicampurkan dengan congo red dan diberikan cat maneval. Menyebabkan warna kapsul transparan, warna badan bakteri merah dengan bentuk bakteri seperti batang, dan warna latarnya hijau.
Kesimpulan
  • Pada metode Burri-Gins, tinta cina digunakan sebagai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan bakteri digunakan fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna merah dan kapsul tidak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo red, sedangkan cat Maneval digunakan sebagai latar belakangnya. Badan bakteri akan berwarna merah, sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang hijau