Kamis, 12 April 2012

macam-macam pengecatan bakteri


Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri merupakan organisme mikroskopis yang mempunyai ciri-ciri : tubuh uniseluler, tidak berklorofil, bereproduksi dengan membelah diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara, dan makhluk hidup), dan aktif bergerak pada kondisi lembab. Beberapa bentuk bakteri yaitu basil, kokus, dan spirilum. Bentuk-bentuk tersebut dapat menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi bergantung pada kondisi pertumbuhannya. Hal ini dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan bakteri (Edukasi, 2008).
Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Salah satu cara untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan in warna (chromophore) yang bermuatan positif sehingga bakteri yang bermuatan negatif menarik chromophore kationik.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi pada 


1.1.Pengecatan Tunggal

Tujuan :
Melihat morfologi (bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna
Teori Dasar
Bakteri bersifat transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telajang. Untuk mengetahui  struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri, kita perlu melakukan pengecatan terhadap bakteri tersebut.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna yang biasa dijadikan utnuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuschin, dan crystal violet. Semua zat warna ini bekerja baik terhadap bakteri karena mengahsilkan ion warna (chromophore) yang mempunyai muatan positif. Bakteri mempunyai muatan negatif sehingga menarik hromophore kationik
Zat warna digolongkan ke dalam zat warna basa contohnya methylene-blue (methylene+ chloride-) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore anionik cotohnya eosin (sodium+ eosinate-). Chromophore anionik, eosinate- tidak dapat dipakai mengecat bakteri. Waktu pengecatan antara 30 detik - 2 menit tergantung pada afinitas zat warna. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah 





1.1.Pengecatan Spora Bakteri (Metode Klein dan Wirtz)
Tujuan :
Melihat bentuk spora di dalam sel bakteri.
Teori :
Bakteri dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetative menjadi spora bila keadaan memburuk. Pada bentuk spora kegiatan bakteri akan berhenti ( dorman atau tidak melakukan metabolisme dan tidak bereproduksi). Dalam bentuk ini bakteri sangat resisten dan dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama meskipun lingkungan dalam keadaan yang kurang baik.
Sifat spora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Berdasarkan letak sporanya dikenal tiga macam letak, yaitu: sentral, subterminal dan terminal.
Berdasarkan posisinya bakteri dibedakan atas:
1.  Endospora, dibentuk didalam sel itu sendiri.
  1. Ditengah sel (sentral). Contoh Bacillus Cereus.
  2. Di ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium thuringensis.
  3. Didekat ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium subterminale.
Endospora adalah tubuh kecil yang tahan lama terbentuk didalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru.
1.      Eksospora, dibentuk diluar sel. Contoh Streptomyces. Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal, seperti konidia, yang disangga diujung hifa, suatu filamen vegetatif, pada streptomyces. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora pada cendawan.
Prosedur Kerja
Bahan dan Alat :
1.      Biakan murni Bacillus subtilis
2.      Zat kimia / warna carbol fuchsin, methylene blue, malachite green, safranin.
3.      Asam sulfat dan alkohol.
4.      Gelas objek, Ose, dan Tabung reaksi
5.      Penangas air, Termometer
6.      Mikroskop

Cara Kerja :
A.    Metode Klein I
1.      Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuschin dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1.
2.      Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada temperatur  80 0 C .
3.      Buat film dari campuran suspensi diatas.
4.      Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik.
5.      Cuci dengan air, lalu tambahkan methylene blue selama 3 menit.
6.      Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
7.      Amati dengan perbesaran kuat.
8.      Catat dan gambar apa yang terlihat. Spora berwarna merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.
B.     Metode Klein II
1.      Buat film dari suspensi bakteri
2.      Tambahkan carbol fuschin, panaskan sampai keluar uap . (80 0 C selam 10 menit )..
3.      Langkah-langkah selanjutnya sama dengan metode klein I.
C.     Metode Wirtz
1.      Buat film dari suspensi bakteri.
2.      Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap kurang lebih selama 2 menit.
3.      Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 30 detik.
4.      Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
5.      Amati dengan perbesaran kuat.
6.      Catat dan amati apa yang terlihat. Spora berwarna hijau dan badan bakteri berwarna merah muda.


Hasil dan Pembahasan
Metode Klein II  
Bacillus subtilis 
Badan vegetative: warna biru
Spora : warna merah muda
sel vegetatif: bentuk batang







Metode Wirtz
Bacillus subtilis 
Badan vegetative: merah muda
Spora : warna hijau
sel vegetatif: bentuk batang







Pembahasan
Pada percobaan metode klein II ini, dapat dilihat bahwa setelah pemberian asam sulfat dan methylene blue di atas, dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, bakteri Bacillus subtilus memiliki sel vegetatifnya berbentuk batang dan berwarna biru. Dengan latar sporanya di luar sel vegetatif, dan warna sporanya itu sendiri adalah merah.
Sel spora bakteri memiliki RNA yang mampu mengikat warna sehingga tetap mempertahankan warna merah yang diberikan carbol fuchsin. Sedangkan sel vegetatif tidak mampu mengikat warna merah sehingga sel vegetatif tidak berwarna.  Sel-sel vegetatif baru berwarna biru setelah di beri zat warna methylene blue.
Sedangkan pada percobaan yang kedua yaitu menggunakan metode Wirtz juga sama, pada perobaan bakteri yang digunakan adalah Bacillus subtilis tetapi zat warna yang digunakan adalah malachite green, dan pada percobaan ini menggunakan zat warna tandingan yaitu safranin. Sehingga setelah diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, menghasilkan sel vegetatifnya berbentuk seperti batang, dan berwarna merah muda. Latar sporanya berada di luar sel vegetatif, dengan warna sporanya itu sendiri adalah hijau.
Malachite green merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah muda dari safranin. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Bacillus pada umumnya bersifat aerobic. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki endospora. Endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian. Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Ncbi, 2008).

Kesimpulan
·         Pada bakteri Bacillus subtilis dengan menggunakan metode klein II spora berwarna merah karena diberikan fuchsin, sedangkan sel vegatatif berwarna biru karena diberikan methylene blue.
·         Pada percobaan yang menggunakan metode Wirtz sel spora berwarna hijau karena terwarnai oleh malachite green, sedangkan sel vegetatif berwarna merah muda karena terwarnai oleh safranin.

1.2.Pengecatan Kapsul Bakteri (Metode Buri-Gins dan Maneval)
Tujuan :
Melihat keberadaan kapsul bakteri.
Teori :
Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis bakteri terdapat suatu zat semacam lendir atau gum. Karena zat tersebut mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka struktur demikian disebut dengan kapsul bakteri.
Struktur kapsul dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri itu sendiri dan jenis bahan makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan ekskresi dari dinding sel bakteri itu sendiri dan berfungsi untuk melindungi dirinya..
Adanya kapsul pada bakteri pathogen mempunyai hubungan erat dengan virulensi bakteri itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang tebal mempunyai virulensi yang lebih tinggi dari pada bakteri dengan kapsul yang tipis atau dengan bakteri yang tidak berkapsul sama sekali.
Pengecatan kapsul disebut juga pengecatan negatif, karena disini yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan objeknya sendiri (kapsul) tidak diwarnai.
Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan sel bakteri digunakan Fuchsin, sehingga badan bakteri menjadi berwarna merah dan kapsulnya didak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval bakteri diwarnai dengan menggunakan Congo red, sedangkan untuk mewarnai latar belakangnya diberi cat Maneval. Badan bakteri akan berwarna merah sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang berwarna hijau.
Bahan dan Alat :
1.      Biakan murni Azotobacter chroococum atau Bacillus subtilis
2.      Zat kimia/warna larutan fuchsin, Congo red, tinta cina, cat maneval, dan media cair.
3.      Gelas objek, Ose, Lampu spirtus, dan Mikroskop
Cara Kerja :
A.    Metode Buri-Gins
  1. Bersihkan gelas objek.
  2. Teteskan satu ose suspensi bakteri di atas gelas objek pada bagian ujungnya.
  3. Teteskan 1-2 ose tinta cina di dekatnya, lalu campurkan.
  4. Buat preparat hapus dengan cara mendorong ke depan dengan menggunakan gelas objek lain.
  5. Keringkan di udara.
  6. Tambahkan carbol fuchsin selama 1-2 menit.
  7. Keringkan dengan kertas saring.
  8. Amati dengan perbesaran kuat.
  9. Catat dan amati apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam.
B.     Metode Maneval
  1. Teteskan 2 ose Congo red pada gelas objek.
  2. Ambil 2 ose suspensi bakteri, lalu mencampurkan dengan congo red tadi. Membuat film setipis mungkin.
  3. Keringkan di udara.
  4. Tambahkan cat Maneval , diamkan selama 1 menit.
  5. Keringkan dengan kertas saring.
  6. Amati preparat dengan perbesaran kuat.
  7. Catat dan gambar apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri berwarna merah dengan latar belakang biru.

Hasil Pengamatan
Metode Maneval
                Bacillus subtilis

Badan bakteri: warna merah
Kapsul: tidak berwarna
Latar belakang: hijau.





Pembahasan
Umumnya tidak semua bakteri itu memiliki kapsul, sedangkan fungsi kapsul itu sendiri adalah untuk mendekatkan pada media. Pada percobaan ini, bakteri diberikan setetes sampai 2 tetes tinta cina, setelah itu diberikan karbol fuchsin, dan diamati, sehingga dihasilkan warna kapsul transparan, sedangkan warna pada badan bakteri tersebut merah, dengan warna latarnya adalah hitam.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo, 1990).
            Sedangkan pada percobaan dengan meggunakan metode maneval didapat bahwa bakteri setelah dicampurkan dengan congo red dan diberikan cat maneval. Menyebabkan warna kapsul transparan, warna badan bakteri merah dengan bentuk bakteri seperti batang, dan warna latarnya hijau.
Kesimpulan
  • Pada metode Burri-Gins, tinta cina digunakan sebagai latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan bakteri digunakan fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna merah dan kapsul tidak berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval, untuk mewarnai badan bakteri digunakan Congo red, sedangkan cat Maneval digunakan sebagai latar belakangnya. Badan bakteri akan berwarna merah, sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang hijau

Tidak ada komentar:

Posting Komentar