Pendahuluan
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri merupakan organisme
mikroskopis yang mempunyai ciri-ciri : tubuh uniseluler, tidak berklorofil,
bereproduksi dengan membelah diri, habitatnya dimana-mana (tanah, air, udara,
dan makhluk hidup), dan aktif bergerak pada kondisi lembab. Beberapa bentuk
bakteri yaitu basil, kokus, dan spirilum. Bentuk-bentuk tersebut dapat
menunjukkan karakteristik spesies bakteri, tetapi bergantung pada kondisi
pertumbuhannya. Hal ini dipengaruhi
oleh keadaan lingkungan, medium, dan bakteri (Edukasi, 2008).
Bakteri bersifat transparan
dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.
Salah satu cara untuk mengetahui struktur, morfologi, dan sifat kimia bakteri
sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau
pewarnaan. Zat warna yang biasa dijadikan untuk mengecat bakteri adalah
methylene blue, basic fuchsin, dan crystal violet. Zat warna ini menghasilkan
in warna (chromophore) yang bermuatan
positif sehingga bakteri yang bermuatan negatif menarik chromophore kationik.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel
bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan
negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam
ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan
Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi pada
1.1.Pengecatan
Tunggal
Tujuan
:
Melihat morfologi
(bentuk susunan) bakteri dengan menggunakan satu macam zat warna
Teori
Dasar
Bakteri bersifat
transparan dan berukuran sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata
telajang. Untuk mengetahui struktur,
morfologi, dan sifat kimia bakteri, kita perlu melakukan pengecatan terhadap
bakteri tersebut.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai
sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri
mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,
peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Zat warna yang
biasa dijadikan utnuk mengecat bakteri adalah methylene blue, basic fuschin,
dan crystal violet. Semua zat warna ini bekerja baik terhadap bakteri karena
mengahsilkan ion warna (chromophore) yang mempunyai muatan positif. Bakteri
mempunyai muatan negatif sehingga menarik hromophore kationik
Zat warna
digolongkan ke dalam zat warna basa contohnya methylene-blue (methylene+
chloride-) sedangkan zat warna asam yang mempunyai chromophore
anionik cotohnya eosin (sodium+ eosinate-). Chromophore
anionik, eosinate- tidak dapat dipakai mengecat bakteri. Waktu
pengecatan antara 30 detik - 2 menit tergantung pada afinitas zat warna. Suatu
preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer
maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan
terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam,
dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan
pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi beberapa genus anggota dari
genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metode
tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi
manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi
mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan
mikroorganisme lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin
(lipoidal) yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan
tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak
mudah
1.1.Pengecatan
Spora Bakteri (Metode Klein dan Wirtz)
Tujuan :
Melihat
bentuk spora di dalam sel bakteri.
Teori :
Bakteri
dapat mengubah dirinya dari bentuk vegetative menjadi spora bila keadaan
memburuk. Pada bentuk spora kegiatan bakteri akan berhenti ( dorman atau tidak
melakukan metabolisme dan tidak bereproduksi). Dalam bentuk ini bakteri sangat
resisten dan dapat bertahan hidup dalam waktu yang lama meskipun lingkungan
dalam keadaan yang kurang baik.
Sifat
spora yang demikian menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk
mewarnainya. Berdasarkan letak sporanya dikenal tiga macam letak, yaitu:
sentral, subterminal dan terminal.
Berdasarkan
posisinya bakteri dibedakan atas:
1. Endospora, dibentuk didalam sel itu
sendiri.
- Ditengah
sel (sentral). Contoh Bacillus
Cereus.
- Di
ujung sel (terminal). Contohnya Clostridium
thuringensis.
- Didekat
ujung (sub terminal). Contohnya Clostridium
subterminale.
Endospora adalah tubuh kecil yang tahan lama
terbentuk didalam sel dan mampu tumbuh menjadi organisme vegetatif yang baru.
1.
Eksospora, dibentuk diluar sel. Contoh Streptomyces. Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal, seperti
konidia, yang disangga diujung hifa, suatu filamen vegetatif, pada streptomyces. Proses ini serupa dengan
proses pembentukan spora pada cendawan.
Prosedur
Kerja
Bahan dan
Alat :
1.
Biakan murni Bacillus subtilis
2.
Zat kimia /
warna carbol fuchsin, methylene blue, malachite green, safranin.
3.
Asam sulfat
dan alkohol.
4.
Gelas objek,
Ose, dan Tabung reaksi
5.
Penangas air,
Termometer
6.
Mikroskop
Cara
Kerja :
A. Metode Klein I
1. Campurkan suspensi bakteri dengan carbol fuschin
dalam tabung reaksi dengan perbandingan 1:1.
2. Panaskan dalam penangas air selama10 menit pada
temperatur 80 0 C .
3. Buat film dari campuran suspensi diatas.
4. Celupkan ke dalam asam sulfat selama 1-2 detik.
5. Cuci dengan air, lalu tambahkan methylene blue
selama 3 menit.
6. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
7. Amati dengan perbesaran kuat.
8. Catat dan gambar apa yang terlihat. Spora berwarna
merah sedangkan bentuk vegetatif berwarna biru.
B. Metode Klein II
1. Buat film dari suspensi bakteri
2. Tambahkan carbol fuschin, panaskan sampai keluar uap
. (80 0 C selam 10 menit )..
3. Langkah-langkah selanjutnya sama dengan metode klein
I.
C. Metode Wirtz
1. Buat film dari suspensi bakteri.
2. Tambahkan malachite green, panaskan sampai menguap
kurang lebih selama 2 menit.
3. Cuci dengan air, tambahkan safranin selama 30 detik.
4. Cuci dengan air, keringkan dengan kertas saring.
5. Amati dengan perbesaran kuat.
6. Catat dan amati apa yang terlihat. Spora berwarna
hijau dan badan bakteri berwarna merah muda.
Hasil dan Pembahasan
Metode Klein II
Bacillus
subtilis
|
Badan vegetative: warna biru
Spora : warna merah muda
sel
vegetatif: bentuk batang
|
Metode Wirtz
Bacillus
subtilis
|
Badan vegetative: merah muda
Spora : warna hijau
|
Pembahasan
Pada percobaan metode klein II ini, dapat dilihat bahwa
setelah pemberian asam sulfat dan methylene blue di atas, dan diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 100 X, bakteri Bacillus subtilus memiliki
sel vegetatifnya berbentuk batang dan berwarna biru. Dengan latar sporanya di
luar sel vegetatif, dan warna sporanya itu sendiri adalah merah.
Sel spora bakteri memiliki RNA yang mampu mengikat warna
sehingga tetap mempertahankan warna merah yang diberikan carbol fuchsin.
Sedangkan sel vegetatif tidak mampu mengikat warna merah sehingga sel vegetatif
tidak berwarna. Sel-sel vegetatif baru
berwarna biru setelah di beri zat warna methylene blue.
Sedangkan pada percobaan yang kedua yaitu menggunakan
metode Wirtz juga sama, pada perobaan bakteri yang digunakan adalah Bacillus
subtilis tetapi zat warna yang digunakan adalah malachite green, dan pada
percobaan ini menggunakan zat warna tandingan yaitu safranin. Sehingga setelah
diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 X, menghasilkan sel
vegetatifnya berbentuk seperti batang, dan berwarna merah muda. Latar sporanya
berada di luar sel vegetatif, dengan warna sporanya itu sendiri adalah hijau.
Malachite green merupakan
pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan
malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.
Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda
pada sel vegetatifnya. Saat diwarnai oleh malachite, sel vegetatif dapat
mengikat warna tetapi dapat luntur setelah dilunturkan karena ikatannya tidak
kuat. Setelah pewarnaan selanjutnya dengan safranin, sel vegetatif mudah
mengikat warna kembali. Oleh karena itu, hasil pewarnaan akhir adalah merah
muda dari safranin. B. Subtilis akan berwarna hijau setelah pengecatan. Bacillus
pada umumnya bersifat aerobic. Hal ini berarti B. Subtilis memiliki
endospora. Endospora lebih tahan
lama meski dalam keadaan linghkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan
kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan.
Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna
sehingga saat diberi warna dari safranin tetap berwarna hijau karena spora
sudah mengikat malachite dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian.
Bacillus subtilis memiliki endospora yang terletak di subterminal (Ncbi, 2008).
Kesimpulan
·
Pada
bakteri Bacillus subtilis dengan
menggunakan metode klein II spora berwarna merah karena diberikan fuchsin,
sedangkan sel vegatatif berwarna biru karena diberikan methylene blue.
·
Pada
percobaan yang menggunakan metode Wirtz sel spora berwarna hijau karena
terwarnai oleh malachite green, sedangkan sel vegetatif berwarna merah muda
karena terwarnai oleh safranin.
1.2.Pengecatan
Kapsul Bakteri (Metode Buri-Gins dan Maneval)
Tujuan :
Melihat
keberadaan kapsul bakteri.
Teori :
Pada bagian sebelah luar dari dinding sel beberapa jenis
bakteri terdapat suatu zat semacam lendir atau gum. Karena zat tersebut
mengelilingi bakteri dan menyerupai kapsul, maka struktur demikian disebut
dengan kapsul bakteri.
Struktur
kapsul dapat tipis atau tebal tergantung pada jenis bakteri itu sendiri dan jenis
bahan makanan yang terkandung dalam media atau substrat. Kapsul merupakan
ekskresi dari dinding sel bakteri itu sendiri dan berfungsi untuk melindungi
dirinya..
Adanya kapsul pada bakteri pathogen mempunyai hubungan
erat dengan virulensi bakteri itu sendiri. Bakteri dengan kapsul yang tebal
mempunyai virulensi yang lebih tinggi dari pada bakteri dengan kapsul yang
tipis atau dengan bakteri yang tidak berkapsul sama sekali.
Pengecatan kapsul disebut juga pengecatan negatif, karena
disini yang diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan objeknya sendiri
(kapsul) tidak diwarnai.
Pada metode Burri-Gins dipakai tinta cina untuk mewarnai
latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan sel bakteri digunakan
Fuchsin, sehingga badan bakteri menjadi berwarna merah dan kapsulnya didak
berwarna (transparan) pada latar belakang yang hitam.
Pada metode Maneval bakteri diwarnai dengan menggunakan
Congo red, sedangkan untuk mewarnai latar belakangnya diberi cat Maneval. Badan
bakteri akan berwarna merah sedangkan kapsul tidak berwarna pada latar belakang
berwarna hijau.
Bahan dan Alat :
1. Biakan
murni Azotobacter chroococum atau Bacillus subtilis
2. Zat
kimia/warna larutan fuchsin, Congo red, tinta cina, cat maneval,
dan media cair.
3. Gelas
objek, Ose, Lampu spirtus, dan Mikroskop
Cara
Kerja :
A. Metode
Buri-Gins
- Bersihkan gelas objek.
- Teteskan satu ose suspensi
bakteri di atas gelas objek pada bagian ujungnya.
- Teteskan 1-2 ose tinta cina di
dekatnya, lalu campurkan.
- Buat preparat hapus dengan
cara mendorong ke depan dengan menggunakan gelas objek lain.
- Keringkan di udara.
- Tambahkan carbol fuchsin
selama 1-2 menit.
- Keringkan dengan kertas
saring.
- Amati dengan perbesaran kuat.
- Catat
dan amati apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri
berwarna merah dengan latar belakang berwarna hitam.
B. Metode
Maneval
- Teteskan 2
ose Congo red pada gelas objek.
- Ambil 2 ose
suspensi bakteri, lalu mencampurkan dengan congo red tadi. Membuat film
setipis mungkin.
- Keringkan
di udara.
- Tambahkan
cat Maneval , diamkan selama 1 menit.
- Keringkan
dengan kertas saring.
- Amati
preparat dengan perbesaran kuat.
- Catat dan
gambar apa yang terlihat. Kapsul tidak berwarna sedangkan badan bakteri
berwarna merah dengan latar belakang biru.
Hasil
Pengamatan
Metode Maneval
Bacillus subtilis
|
Badan bakteri: warna merah
Kapsul: tidak berwarna
Latar belakang: hijau.
|
Pembahasan
Umumnya tidak semua
bakteri itu memiliki kapsul, sedangkan fungsi kapsul itu sendiri adalah untuk
mendekatkan pada media. Pada percobaan ini, bakteri diberikan setetes sampai 2
tetes tinta cina, setelah itu diberikan karbol fuchsin, dan diamati, sehingga
dihasilkan warna kapsul transparan, sedangkan warna pada badan bakteri tersebut
merah, dengan warna latarnya adalah hitam.
Pewarnaan negatif, metode ini bukan
untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan
(tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras
dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar
kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo,
1990).
Sedangkan
pada percobaan dengan meggunakan metode maneval didapat bahwa bakteri setelah
dicampurkan dengan congo red dan diberikan cat maneval. Menyebabkan warna
kapsul transparan, warna badan bakteri merah dengan bentuk bakteri seperti
batang, dan warna latarnya hijau.
Kesimpulan
- Pada metode Burri-Gins, tinta cina digunakan sebagai
latar belakangnya, sedangkan untuk mewarnai badan bakteri digunakan
fuchsin, sehingga badan bakteri berwarna merah dan kapsul tidak berwarna
(transparan) pada latar belakang yang hitam.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar